Reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polimerase chain reaction)

Desde su introducción en 1985, la reacción en cadena de la polimerasa (RCP o PCR) ha transformado totalmente los métodos de aislamiento y amplificación del ADN, tanto en laboratorios de investigación básica como aplicada.

La técnica la descubrió Kary B. Mullis, que diseñó de manera simple y elegante la forma de sintetizar grandes cantidades de ADN in vitro. El descubrimiento le valió el Premio Nóbel en 1993. La PCR ha sustituido en gran medida la amplificación de fragmentos por clonación y tienen numerosas aplicaciones en diversos aspectos de la biología molecular. Es una técnica fundamental e imprescindible en ingeniería genética.

La técnica de PCR permite in vitro la amplificación selectiva de una región particular de DNA imitando el proceso de la replicación del DNA in vivo. Para que se produzca la reacción son necesarios los siguientes componentes:

1. molde de DNA de hebra sencilla,
2. oligonucleótidos (oligos) de secuencia complementaria a los extremos de la región de DNA a amplificar,
3. deoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs),
4. un enzima DNA polimerasa,
5. los tampones en la reacción contienen Mg2+ y cationes monovalentes. Aunque también pueden estar presentes otros “aditivos” que ayudan a estabilizar el enzima polimerasa.

La reacción de PCR requiere tres pasos térmicos:

1. desnaturalización de la doble hebra de DNA a 92-96ºC,
2. anillamiento del oligo en el sitio complementario del molde a 45-72ºC,
3. extensión del oligo en el extremo 3’OH mediante la adición sucesiva de dNTPs. Este paso de extensión tiene lugar a la temperatura a la cual es activa el enzima DNA polimerasa.

Estos tres pasos de desnaturalización, anillamiento y extensión se denominan CICLO. La repetición de dichos ciclos da lugar a la amplificación del DNA.

Si utilizamos dos oligos diferentes –cada uno se une selectivamente a un extremo de cada una de las hebras complementarias- amplificaremos el DNA comprendido entre ambos oligos. La sucesión de una serie de ciclos originará una acumulación exponencial de fragmentos específicos cuyos extremos estarán definidos por los extremos 5’ de los cebadores. Al poder ser utilizados los productos de un ciclo como moldes del ciclo siguiente, el número de copias de ADN, se dobla en cada ciclo.